细胞样本透射电镜实验报告

一、实验器材及试剂

1、 实验器材

2、 主要实验试剂

二、透射电镜制片步骤

1、取材固定：离心收集细胞或细菌沉淀，4°C固定保存及运输。

  1.1 消化离心法

   1）确认细胞数量充足（离心后细胞团约1-2个芝麻大小）。

   2）电镜专用 2.5%戊二醛固定液。

   3）常规胰酶消化细胞，用完全培养基终止消化，离心收集细胞悬液。把细胞悬液置入洁净  1.5ml 尖头 EP 管内。

   4）1000rpm 离心5-10min ，弃去上清，离心后在 ep 管底细胞沉淀成团（细胞团约1-2个芝麻大小）。

   5）弃去上清，留取致密细胞团，缓慢注入1ml 常温 2.5%戊二醛固定液，用牙签挑起，使细胞沉淀不要沉底，室温避光固定3-5min，转入4℃保存。

  1.2 刮除离心法

   1）确认细胞数量充足（离心后细胞团约1-2个芝麻大小），直接倒出培养液后，弃去多余培养基，迅速加足量常温 2.5%戊二醛固定3-5min(戊二醛完全浸没细胞)。

   2）随后用细胞铲或细胞刮成 45°倾角轻柔刮下细胞。顺着一个方向，不要来回刮细胞。

   3）将细胞悬液全部转移到1.5ml 尖头 EP 管内。

   4）转速1000rpm 离心 5min-10min，弃去上清。

   5）细胞沉淀成团（细胞团约1-2个芝麻大小）注入1ml 常温 2.5%戊二醛固定液，用牙签挑起，使细胞沉淀不要沉底，转入4℃保存。

  1.3 .悬浮细胞

   将细胞悬液全部转移到1.5ml 尖头 EP 管（或者15ml尖底离心管）内，转速1000rpm 离心5-10min成团（细胞团约2个芝麻大小），轻轻吸去上清液（切勿丢失细胞），再沿管壁缓缓加入 1ml 常温 2.5%戊二醛，，用牙签挑起，使细胞沉淀不要沉底，室温避光固定3-5min，转入4℃保存。

  2、琼脂预包埋：细胞悬液用离心机1200rpm离心5min，弃上清加入 0.1M 磷酸缓冲液 PB（PH7.4），混匀漂洗 3min 后再1200rpm离心5min，重复洗涤 3 次。弃去上清，细胞沉淀中提前加热溶解制备 1%琼脂糖溶液，稍冷却后加入 EP 管内，在琼脂糖凝固之前将细胞沉淀用镊子挑起悬浮包裹于琼脂糖内。

  3、后固定：0.1M 磷酸缓冲液 PB（PH7.4）配制的 1%锇酸避光室温固定 2h。0.1M 磷酸缓冲液 PB（PH7.4）漂洗 3 次，每次 15min。

  4、 室温脱水：组织依次入 30%-50%-70%-80%-95%-100%-100%酒精上行脱水每次 10min，

100%丙酮两次，每次 10min。

  5、 渗透包埋：丙酮︰812 包埋剂=1︰1， 37℃ 2-4h， 丙酮︰812 包埋剂=1︰2 ，37℃渗透过夜， 纯 812 包埋剂 37℃ 5-8h。将纯 812 包埋剂倒入包埋板，将样品插入包埋板后 37℃烤箱过夜。

  6、 聚合：包埋板放于 60℃烤箱聚合 48h，取出树脂块备用。

  7、 超薄切片：树脂块于超薄切片机 70nm 超薄切片，200 目方华膜铜网捞片。

  8、 染色：铜网于 2%醋酸铀饱和酒精溶液避光染色 10min；超纯水清洗3 次；枸橼酸铅溶液避二氧化碳染色 10min；超纯水清洗 3 次，滤纸稍吸干。铜网切片放入铜网盒内室温干燥过夜。

  9、透射电子显微镜下观察