免疫荧光单标实验报告（TSA法 细胞爬片）

一、实验器材及试剂

1、实验器材

2、主要试剂及货号

3、抗体信息

（1）一抗信息

（2）二抗信息

4、注：一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。

二、实验步骤

1、细胞爬片固定：未经固定的细胞用4%多聚甲醛固定10分钟。已固定的细胞室温放置10分钟，蒸馏水洗。用组化笔在爬片边缘画圈。

2、破膜：用0.1%Triton®X-100破膜15分钟。TBST洗3次，每次5分钟。

3、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

4、孵育一抗：除去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张爬片滴加50-100μl（视细胞爬片大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

5、孵育二抗：第二天从冰箱拿出爬片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张爬片滴加50-100μl（视细胞爬片大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

6、TSA染色：除去TBST，每张爬片滴加50-100μl（视细胞爬片大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

7、染核：除去TBST，每张爬片滴加50-100μl（视细胞爬片大小而定）DAPI工作液（用DAPI原液1:500配制），避光染核5分钟后，用TBST冲洗。

8、封片：用荧光封片剂封片，4℃避光保存。

9、镜检：显微镜下镜检，图像采集分析。

三、结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色，430通道阳性为青色，FITC通道为绿色，Cy3通道阳性为橙红色，Cy5通道阳性为紫红色，Cy7通道为近红外。

四、注意事项

1、冲洗时不应直接将TBST对准爬片，应将喷壶嘴对准孔板壁让水顺板壁流下，避免将爬片上的细胞冲洗掉。

2、实验过程中注意做好标记，在培养皿侧面画上标记，避免将爬片弄混，每个孔的爬片、孔板与孔板盖都应做好标记。