实验报告

免疫荧光三标实验报告（TSA法石蜡切片）

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一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称	厂家	型号
脱水机	常州市中威电子仪器有限公司	TSJ-SD
包埋机	常州市中威电子仪器有限公司	BMJ-A
病理切片机	赛默飞世尔科技有限公司	SHANDON FINESSE 325
冻台	武汉俊杰电子有限公司	JB-L5
组织摊片机	常州市中威电子仪器有限公司	PHY-III
防脱载玻片	湖北百奥斯生物科技有限公司	BP0510
荧光显微镜	奥林巴斯有限公司	BX53
成像系统	3D HISTECH	Pannoramic SCAN Ⅱ
移液枪	大龙兴创实验仪器（北京）股份公司	YE169AA0033229
组化笔	福州迈新生物技术开发有限公司	PEN-0002

2、主要试剂及货号

名称	厂家	型号
无水乙醇	国药集团化学试剂有限公司	100092683
环保透明剂	同声科技
10× 柠檬酸抗原修复液（pH6.0）	湖北百奥斯生物科技有限公司
10× EDTA抗原修复液（pH9.0）	湖北百奥斯生物科技有限公司
30%H2O2	国药集团化学试剂有限公司	10011218
正常驴血清	AntGene	ANT051
正常山羊血清	武汉博士德生物工程有限公司	AR1009
TBS缓冲盐粉	北百奥斯生物科技有限公司	BP0152
洗脱液	湖北百奥斯生物科技有限公司
430-Tyramide	湖北百奥斯生物科技有限公司
FITC-Tyramide	湖北百奥斯生物科技有限公司
Cy3-Tyramide	湖北百奥斯生物科技有限公司
Cy5-Tyramide	湖北百奥斯生物科技有限公司
Cy7-Tyramide	湖北百奥斯生物科技有限公司
DAPI溶液	Solarbio	C0060
荧光封片剂	Southern Biotech	0100-01

3、抗体信息

（1）一抗信息

名称	公司	货号	浓度	修复方式	孵育条件

（2）二抗信息

名称	公司	货号	浓度	孵育条件

4、注：一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。

二、实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水：依次于环保脱蜡剂(1)、环保脱蜡剂(2)、环保脱蜡剂(3)中分别脱蜡10分钟，然后经无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各5分钟。蒸馏水洗3次，每次3分钟，然后浸洗。

2、抗原修复：根据实验条件选择合适的修复液及修复方式。
（1）高温高压修复（EDTA，pH9.0）：在高压锅中加入EDTA（pH9.0）抗原修复液，修复液的体积应浸过切片。虚盖盖子放电磁炉上加热至沸腾（电磁炉为2100瓦）。将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中，盖紧盖子，稍停等气嘴顶起，加限压阀（调整电磁炉功率为1200瓦），待高压锅喷气后严格计时1分30秒，然后停火。冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温（25-30℃，约1小时）后，将切片从修复液中取出，TBST浸洗3次，每次5分钟。
高温高压修复（柠檬酸，pH6.0）：在高压锅中加入柠檬酸（pH6.0）抗原修复液，修复液的体积应浸过切片。虚盖盖子放电磁炉上加热至沸腾（电磁炉为2100瓦）。将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中，盖紧盖子，稍停等气嘴顶起，加限压阀（调整电磁炉功率为1200瓦），待高压锅喷气后严格计时2分钟，然后停火。冷水冲淋高压锅，气压下降后打开锅盖，待修复液自然冷却至室温（25-30℃，约1小时）后，将切片从修复液中取出，蒸馏水浸洗3次，每次5分钟。
（3）微波修复：在修复盒内加入抗原修复液（EDTA pH9.0或柠檬酸pH6.0），将脱蜡水化后的组织切片放入修复盒内，修复液的体积应浸过切片。虚盖盖子，将装有待修复切片的修复盒放入微波炉内，调整微波炉的功率至高火档位，时间设置为3分钟。第一轮修复结束后，将修复盒从微波炉内取出，待修复液自然冷却至室温（25-30℃，约1小时）后，再重复第一轮的修复操作，进行第二轮与第三轮修复（每次修复后冷却间隔时间约为1小时）。三次修复完成冷却后，再将切片从修复液中取出，蒸馏水浸洗3次，每次5分钟。

3、阻断内源性过氧化物酶：浸洗完成后，将已修复完成的切片浸泡于3%H2O2中，室温避光阻断30分钟，蒸馏水浸洗。

4、画圈：组化笔画圈后，将切片置于TBST中。

5、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

6、孵育第一种一抗：甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

7、孵育二抗：第二天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

8、TSA染色：甩去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

9、洗脱：将切片置于盛满洗脱液的修复盒中，洗脱液应浸过切片，水浴42℃洗脱20分钟。洗脱完成后，将切片从洗脱液中取出，TBST浸洗3次，每次3分钟。

10、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

11、孵育第二种一抗：甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

12、孵育二抗：第三天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

13、TSA染色：甩去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

14、洗脱：将切片置于盛满洗脱液的修复盒中，洗脱液应浸过切片，水浴42℃洗脱20分钟。洗脱完成后，将切片从洗脱液中取出，TBST浸洗3次，每次3分钟。

15、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

16、孵育第三种一抗：甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

17、孵育二抗：第四天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

18、TSA染色：甩去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）酪胺盐工作液，避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

19、染核：除去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）DAPI工作液（用DAPI原液1:500配制），避光染核5分钟后，用TBST冲洗。

20、封片：用荧光封片剂封片，4℃避光保存。

21、镜检：显微镜下镜检，图像采集分析。

三、结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色，430通道阳性为青色，FITC通道为绿色，Cy3通道阳性为橙红色，Cy5通道阳性为紫红色，Cy7通道为近红外。