免疫荧光三标实验报告（冰冻切片）

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名称	公司	货号	浓度	修复方式	孵育条件

名称	公司	货号	浓度	孵育条件

4、注：一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。

1、冰冻切片固定：冰冻切片室温晾干，常规固定，于蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。

2、抗原修复冰冻切片常规不修复，特殊情况可选择性的进行抗原修复。

3、画圈：组化笔画圈后，将切片置于TBST中。

4、破膜：用0.1%Triton®X-100破膜15分钟。TBST洗3次，每次5分钟。

5、封闭：5、滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

6、孵育一抗：6、甩去血清，分别取3种一抗原液，用10%血清稀释，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

7、孵育二抗：第二天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。分别取3种二抗原液，用TBST稀释，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

8、染核：8、除去TBST，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）DAPI工作液（用DAPI原液1:500配制），避光染核5分钟后，用TBST冲洗。

9、封片：9、用荧光封片剂封片，4℃避光保存。

10、镜检：显微镜下镜检，图像采集分析。

DAPI通道细胞核为蓝色，488通道阳性为绿色，555通道阳性为橙红色，594通道阳性为红色，647通道阳性为紫红色。