免疫组化实验报告（冰冻切片）

一、实验器材及试剂

1、实验器材

2、主要试剂及货号

3、抗体信息

（1）一抗信息

（2）二抗信息

4、注：一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。

二、实验步骤

1、冰冻切片固定：1、冰冻切片室温晾干，常规固定，于蒸馏水洗涤3次，每次5分钟。

2、抗原修复冰冻切片常规不修复，特殊情况可选择性的进行抗原修复。

3、画圈：组化笔画圈后，将切片置于TBST中。

4、破膜：用0.1%Triton®X-100破膜15分钟。TBST洗3次，每次5分钟。

5、阻断内源性过氧化物酶：将切片浸泡于3%H2O2中，室温避光阻断20分钟，蒸馏水浸洗后，浸泡于TBST中。

6、封闭：滴加与二抗来源一致的10%血清，37℃孵育30分钟。

7、孵育一抗甩去血清，用10%血清稀释一抗原液，配制成一抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）一抗工作液，4℃孵育过夜。

8、孵育二抗第二天从冰箱拿出切片，置于室温放置15分钟（复温），用TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。用TBST稀释二抗原液，配制成二抗工作液，每张切片滴加50-100μl（视组织大小而定）二抗工作液，37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次，再浸洗3次，每次3分钟。

9、DAB显色：甩去TBST，每张切片滴加50ul--100ul（视组织大小而定）新鲜配制的DAB显色液，用计时器计时并在镜下观察显色情况，用自来水清洗终止显色反应并记录显色时间。

10、染核：苏木素染核1分钟，洗净，盐酸酒精分化1-2秒，洗净，返蓝液返蓝数秒后洗净，于显微镜下观察细胞核着色情况。

11、干燥：将染核的片子依次浸泡于两缸无水酒精中，每缸浸泡2min，然后将切片置于室温自然晾干或者37℃恒温箱内烘干。

12、封片：用环保型封片剂（或中性树脂胶）封片，放于阴凉干燥处保存。

13、镜检：显微镜下镜检，图像采集分析。

三、结果判读

DAB显出的阳性表达为深棕褐色，苏木素染细胞核呈蓝色。