Tunel-DAB（石蜡切片）

一、实验器材及试剂

主要试剂

1. 罗氏Tunel试剂盒（货号：11684817910）

注意：做TUNEL当天早晨放到4℃冰箱复温解冻

2. 蒸馏水（PH7.25~7.35）

3. TBS（湖北百奥斯生物科技有限公司）

4. 康莱透明脱蜡剂

5. 酒精（国药集团 10009218）三个梯度100%、95%、75%

6. Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）

7. DAB显色剂（DAKO code:k5007）

8. 盐酸酒精（湖北百奥斯生物科技有限公司）

9. 正常山羊血清（博士德 AR1009）

10. 30%H2O2（国药集团 10011218）

11. 苏木素（BaSo BA-4041）

实验器材

湿盒、移液枪、离心管、修复盒、组画笔、封片剂（盖宝）

二、实验步骤

1.石蜡切片脱蜡至水，环保透明剂（三缸10min,10min,10min），梯度酒精（无水、95%、75%）每缸5min，自来水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗一次，然后用组化笔画圈并浸泡于TBS中。

2.Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）室温滴加，通透8min。

3.TBS洗3次，每次5min。

3.每张切片滴加10%山羊血清封闭非特异性反应，室温30min，不洗。

4.甩去血清，每张切片滴加Tunel反应混合液，每张50ul临用前配制（A液：B液=1:20）混匀，避光湿盒中37℃孵育60min，阴性对照用TBS代替工作液。（这一步骤注意避光）

5.完成后TBS洗3次，每次5min。

6.3%H2O2（用蒸馏水稀释）阻断，室温避光10min,完成后TBS洗3次，每次5min

7.再次封闭，20%山羊血清37℃封闭20min，不洗。

8.甩去血清，每张切片滴加POD溶液，放在避光盒中37℃孵育30min。完成后TBS洗3次，每次5min。

9.每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液，镜下控制显色，并记录显色时间。

10.终止显色，自来水冲洗，苏木素复染1分钟（时间由苏木素新旧，环境温度以及组织而定）自来水冲洗，盐酸酒精分化1~2秒，自来水冲洗，返蓝液返蓝。

11.切片放置梯度酒精脱水干燥，环保型无毒封片剂封片镜检。