荧光Tunel（冰冻切片）

（一）试剂：

1.TUNEL BrightGreen Apoptosis Detection Kit（诺唯赞Tunel试剂盒 ，货号：A112）

   TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit（诺唯赞Tunel试剂盒 ，货号：A113）

注意：做TUNEL当天早晨放到4℃冰箱复温解冻

2. 蒸馏水（PH7.25~7.35）

3. TBS（湖北百奥斯生物科技有限公司）

4. DAPI（Solarbio C0060）

5. 封片剂（Southern Biotech 0100-01）

6. Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）

仪器：湿盒、移液枪、离心管、修复盒、组化笔

（二）步骤：

1.冰冻切片室温复温15分钟，然后用组化笔画圈，TBS洗涤三次，每次5分钟。（如果组织未固2定，先用4%多聚甲醛进行固定15分钟，然后再画圈，TBS洗涤）

2.Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）室温滴加，通透8min。

3.TBS洗3次，每次5min。

4.按1:100的比例，将2mg/ml的Proteinase K溶液用1×TBS稀释，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加50μl稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全样本区域，室温孵育5min。

5.TBS洗3次，每次5min。

6.按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer。

7.每个样本滴加50μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本。

8.依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。（这一步骤开始注意避光。）一个标准反应其体积是50μl，用50μl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

表1：准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

9.阴性对照体系：准备一份不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶。

10.甩去切片上1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在组织上加入50μl TdT孵育缓冲液。不要让组织干片。这之后的操作，载玻片要避光。

11.将载玻片置于湿盒内，在37℃孵育60min。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。

12.孵育完成后，TBS洗3次，每次5min。

13.DAPI染核，避光室温10min。

14.完成后TBS洗3次，每次5min。

15.抗荧光衰减封片剂封片，避光4℃保存，待检拍照。

（三）注意事项

1.tunel反应试剂每次需要现配现用，不能提前配制。

2.每次都需要加好阳性对照组织，保证实验结果的稳定性。

3.开启新的tunel试剂盒一定先做好验证。保证试剂盒的正常使用。并标记好开启日期。