免疫荧光IF三标（TSA法）

服务介绍：

多重免疫标记技术（mIHC）是近年来病理学研究领域中兴起的一项重要技术方法，该方法是一项基于酪胺信号放大（Tyramide Signal Amplification, TSA）的多重顺次免疫染色技术，可以在细胞或组织样本原位上检测多个目标靶点，通过这些靶点的组合和位置关系的研究，进而阐明其相互作用机理。该技术不仅可大幅提高被检测信号的灵敏度，同时也可解决在同一张切片上进行多种同种属生物标志物检测的难题，通过定量病理分析可获组织细胞原位各种靶标类别、组分、表达量等信息，各靶标及其相互作用的空间定位、定性和定量等信息，全面、系统、直观、科学地解析这些信息对于研究疾病的发生发展机制，对于探讨疾病诊断和治疗疾病的有效方法有着重要的意义。

本项目通过TSA法，可以突破一抗来源的限制，在一张切片上对三个抗原进行标记，无需考虑一抗来源是否相同。可应用于石蜡切片、冰冻切片、细胞涂片、细胞爬片等。

主要用途：

1、原位展示及定量分析双重优势。

2、更全面的分析：药物靶点和肿瘤微环境同时分析。

3、不同靶点自由组合，多靶标共定位染色，也可拆分信号。

4、展示空间位置关系，区分不同细胞亚群。

检测原理：

在过氧化氢存在时，一些酶如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶等可以催化一种酪胺的底物为一种非常活跃的短寿命中间体，在短时间内，中间体可以共价结合到周围蛋白的富电子表面形成酪胺化复合物，由于相接的蛋白（如HRP，抗体，目标抗原）都含有大量的酪氨酸结合位点，因此会富集大量信号，使信号被有效放大。

实验流程：

严格的TSA法多色免疫荧光实验设计：

1、IHC免疫组化预实验 - 验证抗体 - 客户确认结果。

2、IF免疫荧光单标预实验（TSA法） - 验证浓度及颜色搭配调整优化 - 客户确认结果（表达丰度）。

3、IF免疫荧光多标组合测试预实验 - 标记顺序优化确认。

4、IF多标正式实验 - 小批量染色 - 客户确认结果。

5、IF多标正式实验 - 大批量染色 - 客户确认结果。

实验结果：

CD45(green)+Insulin(red)+Glugacon(white)

样本要求及运输条件：

1、提供固定合格的样本。组织离体后，选择合适的固定液立即固定，固定液的量建议大于组织体积的10-15倍，新鲜标本用合适的容器固定24-48h，大标本固定12h，再切开固定。标本常温（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰，固定样本常温运输送样。

2、涂片和爬片必须充分固定，石蜡切片实验前需充分脱蜡。

3、提供准确的抗体信息。

注意事项：

1、客户提供的抗体，要求先做预实验，除了正式实验样本外，需客户提供预实验样本（预期高表达，蜡块和切片皆可）和阳性对照（若不能提供，可以协商由我司提供），TSA多标实验需要严格设置单标对照。

2、抗体：一般指一抗（客户检测目的蛋白），需要客户提供准确的抗体名称、品牌货号，根据抗体货号可以确认抗体的应用（检测种属和检测方式）是否符合基本要求，否则存在风险，具体以预实验为准。接收抗体时，需确认抗体体积与保存温度，建议至少10μl，多余可返还。二抗由我司提供，若客户提供特殊来源的一抗（如：绵羊来源），需客户提供相应二抗。

3、预实验，通常采用3+1+1模式，即三个浓度梯度，一张阳性对照，一张空白对照。预实验确认效果后，再做正式实验，预实验我司可提供免费扫描并放置于服务器（可用网页直接浏览）。预实验结果优先由客户自行确认，并选择正式实验浓度，我司可协助推荐，但不对最终结果作保证，预实验和正式实验间隔周期不要太久，建议连续三周内完成。

4、同一个抗体用于不同种属、不同脏器，浓度都需做预实验确认（可以减少浓度梯度）。

5、正式实验的趋势我司不做保证。