免疫荧光单标实验报告(TSA法 石蜡切片)

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一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称

厂家

型号

脱水机

常州市中威电子仪器有限公司

TSJ-SD

包埋机

常州市中威电子仪器有限公司

BMJ-A

病理切片机

赛默飞世尔科技有限公司

SHANDON FINESSE 325

冻台

武汉俊杰电子有限公司

JB-L5

组织摊片机

常州市中威电子仪器有限公司

PHY-III

防脱载玻片

湖北百奥斯生物科技有限公司

BP0510

荧光显微镜

奥林巴斯有限公司

BX53

成像系统

3D HISTECH

Pannoramic SCAN Ⅱ

移液枪

大龙兴创实验仪器(北京)股份公司

YE169AA0033229

组化笔

福州迈新生物技术开发有限公司

PEN-0002

2、主要试剂及货号

名称

厂家

型号

无水乙醇

国药集团化学试剂有限公司

100092683

环保透明剂

同声科技

10× 柠檬酸抗原修复液(pH6.0)

湖北百奥斯生物科技有限公司

10× EDTA抗原修复液(pH9.0)

湖北百奥斯生物科技有限公司

30%H2O2

国药集团化学试剂有限公司

10011218

正常驴血清

AntGene

ANT051

正常山羊血清

武汉博士德生物工程有限公司

AR1009

TBS缓冲盐粉

北百奥斯生物科技有限公司

BP0152

洗脱液

湖北百奥斯生物科技有限公司

430-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

FITC-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy3-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy5-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy7-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

DAPI溶液

Solarbio

C0060

荧光封片剂

Southern Biotech

0100-01


3、抗体信息

(1)一抗信息

名称

公司

货号

浓度

修复方式

孵育条件

 

 

 

 

 

 


(2)二抗信息

名称

公司

货号

浓度

孵育条件

 

 

 

 

 

4、注:一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。


二、实验步骤

1、石蜡切片脱蜡至水:依次于环保脱蜡剂(1)、环保脱蜡剂(2)、环保脱蜡剂(3)中分别脱蜡10分钟,然后经无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇各5分钟。蒸馏水洗3次,每次3分钟,然后浸洗。

2、抗原修复:根据实验条件选择合适的修复液及修复方式。
(1)高温高压修复(EDTA,pH9.0):在高压锅中加入EDTA(pH9.0)抗原修复液,修复液的体积应浸过切片。虚盖盖子放电磁炉上加热至沸腾(电磁炉为2100瓦)。将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中,盖紧盖子,稍停等气嘴顶起,加限压阀(调整电磁炉功率为1200瓦),待高压锅喷气后严格计时1分30秒,然后停火。冷水冲淋高压锅,气压下降后打开锅盖,待修复液自然冷却至室温(25-30℃,约1小时)后,将切片从修复液中取出,TBST浸洗3次,每次5分钟。
(2)高温高压修复(柠檬酸,pH6.0):在高压锅中加入柠檬酸(pH6.0)抗原修复液,修复液的体积应浸过切片。虚盖盖子放电磁炉上加热至沸腾(电磁炉为2100瓦)。将脱蜡水化后的组织切片放入已沸腾的缓冲液中,盖紧盖子,稍停等气嘴顶起,加限压阀(调整电磁炉功率为1200瓦),待高压锅喷气后严格计时2分钟,然后停火。冷水冲淋高压锅,气压下降后打开锅盖,待修复液自然冷却至室温(25-30℃,约1小时)后,将切片从修复液中取出,蒸馏水浸洗3次,每次5分钟。
(3)微波修复:在修复盒内加入抗原修复液(EDTA pH9.0或柠檬酸pH6.0),将脱蜡水化后的组织切片放入修复盒内,修复液的体积应浸过切片。虚盖盖子,将装有待修复切片的修复盒放入微波炉内,调整微波炉的功率至高火档位,时间设置为3分钟。第一轮修复结束后,将修复盒从微波炉内取出,待修复液自然冷却至室温(25-30℃,约1小时)后,再重复第一轮的修复操作,进行第二轮与第三轮修复(每次修复后冷却间隔时间约为1小时)。三次修复完成冷却后,再将切片从修复液中取出,蒸馏水浸洗3次,每次5分钟。

3、阻断内源性过氧化物酶:浸洗完成后,将已修复完成的切片浸泡于3%H2O2中,室温避光阻断30分钟,蒸馏水浸洗。

4、画圈:组化笔画圈后,将切片置于TBST中。

5、封闭:滴加与二抗来源一致的10%血清,37℃孵育30分钟。

6、孵育一抗:甩去血清,用10%血清稀释一抗原液,配制成一抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)一抗工作液,4℃孵育过夜。

7、孵育二抗:第二天从冰箱拿出切片,置于室温放置15分钟(复温),用TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。用TBST稀释二抗原液,配制成二抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)二抗工作液,37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

8、TSA染色:甩去TBST,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)酪胺盐工作液,避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

9、染核:除去TBST,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)DAPI工作液(用DAPI原液1:500配制),避光染核5分钟后,用TBST冲洗。

10、封片:荧光封片剂封片,4℃避光保存。

11、镜检:显微镜下镜检,图像采集分析。


三、结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色,430通道阳性为青色,FITC通道为绿色,Cy3通道阳性为橙红色,Cy5通道阳性为紫红色,Cy7通道为近红外。