免疫荧光单标实验报告(TSA法 细胞爬片)

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一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称

厂家

型号

防脱载玻片

湖北百奥斯生物科技有限公司

BP0510

荧光显微镜

奥林巴斯有限公司

BX53

成像系统

3D HISTECH

Pannoramic SCAN Ⅱ

移液枪

大龙兴创实验仪器(北京)股份公司

YE169AA0033229

组化笔

福州迈新生物技术开发有限公司

PEN-0002

2、主要试剂及货号

名称

厂家

型号

无水乙醇

国药集团化学试剂有限公司

100092683

Triton® X-100破膜液

BioFroxx

1139ML100

正常驴血清

AntGene

ANT051

正常山羊血清

武汉博士德生物工程有限公司

AR1009

TBS缓冲盐粉

北百奥斯生物科技有限公司

BP0152

洗脱液

湖北百奥斯生物科技有限公司

430-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

FITC-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy3-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy5-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy7-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

DAPI溶液

Solarbio

C0060

荧光封片剂

Southern Biotech

0100-01


3、抗体信息

(1)一抗信息

名称

公司

货号

浓度

修复方式

孵育条件

 

 

 

 

 

 


(2)二抗信息

名称

公司

货号

浓度

孵育条件

 

 

 

 

 

4、注:一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。


二、实验步骤

1、细胞爬片固定:未经固定的细胞用4%多聚甲醛固定10分钟。已固定的细胞室温放置10分钟,蒸馏水洗。用组化笔在爬片边缘画圈。

2、破膜:用0.1%Triton®X-100破膜15分钟。TBST洗3次,每次5分钟。

3、封闭:滴加与二抗来源一致的10%血清,37℃孵育30分钟。

4、孵育一抗:除去血清,用10%血清稀释一抗原液,配制成一抗工作液,每张爬片滴加50-100μl(视细胞爬片大小而定)一抗工作液,4℃孵育过夜。

5、孵育二抗:第二天从冰箱拿出爬片,置于室温放置15分钟(复温),用TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。用TBST稀释二抗原液,配制成二抗工作液,每张爬片滴加50-100μl(视细胞爬片大小而定)二抗工作液,37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

6、TSA染色:除去TBST,每张爬片滴加50-100μl(视细胞爬片大小而定)酪胺盐工作液,避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

7、染核:除去TBST,每张爬片滴加50-100μl(视细胞爬片大小而定)DAPI工作液(用DAPI原液1:500配制),避光染核5分钟后,用TBST冲洗。

8、封片:用荧光封片剂封片,4℃避光保存。

9、镜检:显微镜下镜检,图像采集分析。


三、结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色,430通道阳性为青色,FITC通道为绿色,Cy3通道阳性为橙红色,Cy5通道阳性为紫红色,Cy7通道为近红外。


四、注意事项

1、冲洗时不应直接将TBST对准爬片,应将喷壶嘴对准孔板壁让水顺板壁流下,避免将爬片上的细胞冲洗掉。

2、实验过程中注意做好标记,在培养皿侧面画上标记,避免将爬片弄混,每个孔的爬片、孔板与孔板盖都应做好标记。