免疫荧光三标实验报告(TSA法 冰冻切片)

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一、实验器材及试剂

1、实验器材

名称

厂家

型号

冰冻切片机

赛默飞世尔科技有限公司

HM525 NX U

防脱载玻片

湖北百奥斯生物科技有限公司

BP0510

荧光显微镜

奥林巴斯有限公司

BX53

成像系统

3D HISTECH

Pannoramic SCAN Ⅱ

移液枪

大龙兴创实验仪器(北京)股份公司

YE169AA0033229

组化笔

福州迈新生物技术开发有限公司

PEN-0002

2、主要试剂及货号

名称

厂家

型号

OCT包埋剂

日本樱花SAKURA

4583

Triton® X-100破膜液

BioFroxx

1139ML100

30%H2O2

国药集团化学试剂有限公司

10011218

正常驴血清

AntGene

ANT051

正常山羊血清

武汉博士德生物工程有限公司

AR1009

TBS缓冲盐粉

湖北百奥斯生物科技有限公司

BP0152

洗脱液

湖北百奥斯生物科技有限公司

430-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

FITC-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy3-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy5-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

Cy7-Tyramide

湖北百奥斯生物科技有限公司

DAPI溶液

Solarbio

C0060

荧光封片剂

Southern Biotech

0100-01


3、抗体信息

(1)一抗信息

名称

公司

货号

浓度

修复方式

孵育条件

 

 

 

 

 

 


(2)二抗信息

名称

公司

货号

浓度

孵育条件

 

 

 

 

 

4、注:一抗及二抗信息根据具体实验条件填写。


二、实验步骤

1、冰冻切片固定:冰冻切片室温晾干,常规固定,于蒸馏水洗涤3次,每次5分钟。

2、抗原修复冰冻切片常规不修复,特殊情况可选择性的进行抗原修复。

3、画圈:组化笔画圈后,将切片置于TBST中。

4、破膜:用0.1%Triton®X-100破膜15分钟。TBST洗3次,每次5分钟。

5、阻断内源性过氧化物酶:将切片浸泡于3%H2O2中,室温避光阻断20分钟,蒸馏水浸洗后,浸泡于TBST中。

6、封闭:滴加与二抗来源一致的10%血清,37℃孵育30分钟。

7、孵育第一种一抗甩去血清,用10%血清稀释一抗原液,配制成一抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)一抗工作液,4℃孵育过夜。

8、孵育二抗第二天从冰箱拿出切片,置于室温放置15分钟(复温),用TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。用TBST稀释二抗原液,配制成二抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)二抗工作液,37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

9、TSA染色:甩去TBST,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)酪胺盐工作液,避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

10、洗脱:切片上滴加洗脱液,于烘箱内37℃洗脱45分钟。洗脱完后,TBST浸洗3次,每次5分钟。

11、封闭:滴加与二抗来源一致的10%血清,37℃孵育30分钟。

12、孵育第二种一抗:甩去血清,用10%血清稀释一抗原液,配制成一抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)一抗工作液,4℃孵育过夜。

13、孵育二抗:第三天从冰箱拿出切片,置于室温放置15分钟(复温),用TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。用TBST稀释二抗原液,配制成二抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)二抗工作液,37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

14、TSA染色:甩去TBST,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)酪胺盐工作液,避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

15、洗脱:切片上滴加洗脱液,于烘箱内37℃洗脱45分钟。洗脱完后,TBST浸洗3次,每次5分钟。

16、封闭:滴加与二抗来源一致的10%血清,37℃孵育30分钟。

17、孵育第三种一抗:甩去血清,用10%血清稀释一抗原液,配制成一抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)一抗工作液,4℃孵育过夜。

18、孵育二抗:第四天从冰箱拿出切片,置于室温放置15分钟(复温),用TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。用TBST稀释二抗原液,配制成二抗工作液,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)二抗工作液,37℃孵育45分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

19、TSA染色:甩去TBST,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)酪胺盐工作液,避光室温孵育10分钟。TBST冲洗3次,再浸洗3次,每次3分钟。

20、染核:除去TBST,每张切片滴加50-100μl(视组织大小而定)DAPI工作液(用DAPI原液1:500配制),避光染核5分钟后,用TBST冲洗。

21、封片:用荧光封片剂封片,4℃避光保存。

22、镜检:显微镜下镜检,图像采集分析。


三、结果判读

DAPI通道细胞核为蓝色,430通道阳性为青色,FITC通道为绿色,Cy3通道阳性为橙红色,Cy5通道阳性为紫红色,Cy7通道为近红外。