MSP甲基化检测实验报告

一、实验器材及试剂

1、实验器材

2、主要试剂及货号

二、实验步骤

2.1 组织基因组DNA提取

2.1.1样本前处理

1、动物组织：取约25 mg动物组织用液氮研磨成粉末加到1.5 mL离心管中，加入180 µl Buffer ACL，再加入20 µl Proteinase K溶液，震荡混匀。56°C水浴至细胞完全裂解。在水浴后加入 20 µl RNase A（10 mg/mL），室温放置 2-5 min。

2、贴壁培养细胞：弃尽培养液，每10 cm2细胞加入200 µl Buffer PBS和20 µl Proteinase K，轻轻晃动培养瓶，收集细胞转移至新的离心管中，再加入200 µl Buffer CL，震荡混匀，56°C水浴10 min。在水浴后加入 20 µl RNase A（10 mg/mL），室温放置 2-5 min。继续步骤3~8。

3、悬浮培养细胞：收集细胞，离心去除培养液，加入200 µl Buffer PBS和20 µl Proteinase K，混匀。再加入200 µl Buffer CL，震荡混匀，56°C水浴10 min。在水浴后加入 20 µl RNase A（10 mg/mL），室温放置 2-5 min。继续步骤3~8。

2.1.1样本前处理

2.1.2 加入200 µl Buffer CL，充分颠倒混匀。加入 Buffer CL 后，如有沉淀产生，可 70°C 水浴 10 min。

2.1.3、加入200 µl的无水乙醇，充分颠倒混匀。加入无水乙醇后可能会产生半透明纤维状悬浮物，不影响 DNA 的提取和应用。

2.1.4、将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2 min，再10,000 rpm室温离心1 min，倒掉收集管中废液。

2.1.5、将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 µl CW1 Solution，10,000 rpm离心30 s，倒掉收集管废液。使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。

2.1.6、将吸附柱放回收集管中，向吸附柱中加入500 µl CW1 Solution，10,000 rpm离心30 s，倒掉收集管废液。使用前注意溶液中是否按比例加入无水乙醇。

2.1.7、将吸附柱重新放回收集管中，于12,000 rpm室温离心2 min，离去残留的CW2 Solution。将吸附柱打开盖子于室温放置数分钟，以彻底晾干吸附材料中残留的 CW2 Solution，CW2 Solution 的残留会影响基因组 DNA 的产量和后续的实验。

2.1.8、取出吸附柱，放入一个新的1.5 mL离心管中，加入50-200 µl CE Buffer静置3 min，12,000 rpm室温离心2 min，收集DNA溶液。提取的DNA琼脂糖电泳检测，主带清晰无明显降解可立即进行下一步实验或-20°C保存。。

2.2 重亚硫酸盐处理DNA

2.2.1CT转换液配制：取一支CT conversion Reagent 加入900μL水、300μL M-Dilution Buffer、50μLM-Dissolving Buffer，室温避光震荡15分钟（37℃摇床进行）。（CT转化液用200ul离心管分装至-80℃保存）

2.2.2取约200-500ngDNA至PCR管中，用水补齐至20μL，加入130μLCT转换液。混匀后在PCR仪上进行CT转换。反应程序为 98℃10min，64℃2.5h，4℃保存。

2.2.3在Zymo-SpinTM IC Column中加入600μLM-Binding Buffer，并将Zymo-SpinTM IC Column放在Collection Tube中。

2.2.4 将第二步的产物加入到Zymo-SpinTM IC Column中，室温震荡30min（37℃摇床进行）后12,000g离心30秒。

2.2.5加入100μL M-Wash Buffer，12,000g离心30秒。

2.2.6 加入200μL M-Desulphonation Buffer，室温放置20分钟后，12,000g离心30秒。

2.2.7 加入200μL M-Wash Buffer，12,000g离心30秒。重复步骤7。

2.2.8 将Zymo-SpinTM IC Column放入灭菌的1.5ml离心管中，加入25μL70℃水浴温浴过的M-Elution Buffer。12,000g离心30秒。将离心收集的液体重新放回Zymo-SpinTM IC Column中，12,000g离心30秒，离心管中收集到的即为转换后的DNA。

2.3 PCR扩增

2.3.1 PCR体系（20μL体系）

2.3.2 PCR扩增程序：

2.4 电泳检测：1×TAE，2.0% agarose，4V/cm