荧光Tunel（石蜡切片）

（一）试剂：

1.TUNEL BrightGreen Apoptosis Detection Kit（诺唯赞Tunel试剂盒 ，货号：A112）

TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit（诺唯赞Tunel试剂盒 ，货号：A113）

注意：做TUNEL当天早晨放到4℃冰箱复温解冻

2. 蒸馏水（PH7.25~7.35）

3. TBS（湖北百奥斯生物科技有限公司）

4. 康莱透明脱蜡剂

5. 酒精（国药集团 10009218）三个梯度100%、95%、75%

6. DAPI（Solarbio C0060）

7. 抗荧光衰减封片剂（Southern Biotech 0100-01）

8. Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）

仪器：湿盒、移液枪、离心管、修复盒、组化笔

（二）操作步骤：

1.石蜡切片脱蜡至水，环保透明剂（三缸10min,10min,10min），梯度酒精（无水、95%、75%）每缸5min，自来水冲洗干净后，用蒸馏水冲洗一次，然后用组化笔画圈并浸泡于TBS中。

2.在修复盒中加入抗原修复液（PH6.0）的柠檬酸修复，修复液应没过切片。将修复盒放入微波炉中，中火修复3min30s，待修复液自然冷却至室温（25-30℃）(约1hr）后，将切片从修复液中取出，置于蒸馏水中浸洗3分钟。

3.TBS洗3次，每次5min。

4.依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。（这一步骤开始注意避光。）一个标准反应其体积是50μl，用50μl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

表1：准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

5.阴性对照体系：准备一份不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶。

6.甩去切片上1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在组织上加入50μl TdT孵育缓冲液。不要让组织干片。这之后的操作，载玻片要避光。

7.将载玻片置于湿盒内4℃过夜。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。

8.将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时15--20min后用TBS冲洗，后将切片置于铁架上，用蒸馏水冲洗切片2-3次后，将切片置于加过吐温的TBS中浸泡冲洗3次/5min。

9.DAPI染核，避光室温5min。

10.完成后TBS洗3次，每次5min。

11.抗荧光衰减封片剂封片，避光4℃保存，待检拍照。

（三）注意事项

1.tunel反应试剂每次需要现配现用，不能提前配制。

2.每次都需要加好阳性对照组织，保证实验结果的稳定性。

3.开启新的tunel试剂盒一定先做好验证。保证试剂盒的正常使用。并标记好开启日期。