荧光Tunel（细胞爬片）

（一）            试剂：

1.TUNEL BrightGreen Apoptosis Detection Kit（诺唯赞Tunel试剂盒 ，货号：A112）

TUNEL BrightRed Apoptosis Detection Kit（诺唯赞Tunel试剂盒 ，货号：A113）

注意：做TUNEL当天早晨放到4℃冰箱复温解冻

2. 蒸馏水（PH7.25~7.35）

3. TBS（湖北百奥斯生物科技有限公司）

4. DAPI（Solarbio C0060）

5. 封片剂（Southern Biotech 0100-01）

6. Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）

仪器：湿盒、移液枪、离心管、修复盒、组化笔

（二）            操作步骤：

1.细胞室温复温15分钟，然后用组化笔沿着爬片边缘画圈，TBS洗涤三次，每次5分钟。（如果细胞未固定，先用4%多聚甲醛室温进行固定15分钟，然后再画圈，TBS洗涤）.

2.把柠檬酸修复液加入到细胞孔板里放入到60℃恒温箱1h。

3.Tu破膜液（0.1%TritonX-100,0.1%柠檬酸钠）室温滴加，通透5min。

4.按1:100的比例，将2mg/ml的Proteinase K溶液用1×TBS稀释，使其终浓度为20μg/ml。每个样本上滴加50μl稀释好的Proteinase K溶液，使溶液覆盖全样本区域，室温孵育5min。

5.TBS洗3次，每次5min。 

6.按1:5的比例用去离子水稀释5×Equilibration Buffer。

7.每个样本滴加50μl 1×Equilibration Buffer使其全部覆盖待检样本区域，室温孵育30分钟。或者将载玻片放入一个含有1×Equilibration Buffer的缸中，保证缓冲液没过样本。

8.依照表1，准备足够量的用于所有实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液。（这一步骤开始注意避光。）一个标准反应其体积是50μl，用50μl乘以实验和阳性对照反应的数目来确定所需TdT孵育缓冲液的总体积。对于表面积更大的样本，可成比例的增大试剂体积。

表1：准备用于实验的和可选阳性对照反应的TdT孵育缓冲液

9.阴性对照体系：准备一份不含TdT酶的对照孵育缓冲液，用ddH2O替代TdT酶。

甩去切片上1×Equilibration Buffer中的大部分，然后在组织上加入50μl TdT孵育缓冲液。不要让组织干片。这之后的操作，载玻片要避光。

10.将载玻片置于湿盒内4℃过夜。将湿盒用铝箔纸包裹以避光。

11.将湿盒从冰箱取出，分散依次摊开进行复温，计时15--20min后用TBS冲洗，后将切片置于铁架上，用蒸馏水冲洗切片2-3次后，将切片置于加过吐温的TBS中浸泡冲洗3次/5min。

12.DAPI染核，避光室温5min。

13.完成后TBS洗3次，每次5min。

14.抗荧光衰减封片剂封片，避光4℃保存，待检拍照。

（三）注意事项

1.tunel反应试剂每次需要现配现用，不能提前配制。

2.每次都需要加好阳性对照组织，保证实验结果的稳定性。

3．开启新的tunel试剂盒一定先做好验证。保证试剂盒的正常使用。并标记好开启日期。

4.细胞爬片要先固定再开展后续实验。

5.开始前要提前观察细胞的形态及密度，如果有异常要终止后续实验。

6.细胞爬片不能长久放置，所以要优先安排实验。