TUNEL染色（DAB）

服务介绍：

TUNEL（TdT-mediated dUTP nick end labeling）又称脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法，是一种检测细胞在凋亡过程中细胞核DNA断裂情况的方法，本实验为组织样本的TUNEL（DAB）检测，其原理是荧光素（fluorescein）标记的dUTP在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT Enzyme）的作用下，可以连接到凋亡细胞中断裂的3'-OH末端，并与连接辣根过氧化物酶（HRP，horse-radish peroxidase）的荧光素抗体特异性结合，后又与HRP底物二氨基联苯胺（DAB）反应产生很强的颜色反应（呈深棕色），特异准确地定位正在凋亡的细胞。此方法适用于组织样本（石蜡切片、冰冻切片）和细胞样本（细胞涂片、细胞爬片）在单细胞水平上的凋亡原位检测。

主要用途：

检测组织中凋亡细胞数量的多少。

检测原理：

细胞凋亡中染色体DNA的断裂是一个渐进的分阶段过程，染色体DNA首先在内源性的核酸水解酶的作用下降解为50-300kb的大片段。然后，约30%的染色体DNA在Ca²⁺和Mg²⁺依赖的核酸内切酶作用下，在核小体单位之间被随机切断，形成180-200bp核小体DNA多聚体。DNA双键断裂或只要一条链上出现缺口，而产生的一系列DNA的3'-OH末端可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-OH末端，从而可进行凋亡细胞的检测。由于正常的或正在增殖的细胞几乎没有DNA断裂，因而没有3'-OH形成，很少能够被染色。

实验流程：

石蜡切片脱蜡至水-Proteinase K处理-PBS洗涤-TUNEL Dilution Buffer孵育-TUNEL reaction mixture孵育-PBS洗涤-Converter-POD孵育-PBS洗涤-DAB显色-PBS洗涤-封片-显微镜镜检。

样本要求及运输条件：

1、提供固定合格的样本。组织离体后，选择合适的固定液立即固定，固定液的量建议大于组织体积的10-15倍，新鲜标本用合适的容器固定24-48h，大标本固定12h，再切开固定。标本常温（24℃左右）或冷藏（4℃）固定，切勿冷冻结冰，固定样本常温运输送样。

2、涂片和爬片必须充分固定，石蜡切片实验前需充分脱蜡。

注意事项：

1、任何实验方法都存在局限性，根据TUNEL实验的本质问题，公司不能保证结果中凋亡细胞的多少（即假阳性、或偏阴性结果）。每批凋亡染色，公司会提供阳性对照。

2、TUNEL染色建议先做预实验（预实验由客户提供预期高表达的样本，蜡块或切片皆可），确认效果后，再做正式实验，建议将预实验的样本加到正式试验中进行质控。预实验我司可提供免费扫描并放置于服务器（可用网页直接浏览）。预实验结果优先由客户自行确认，预实验和正式实验间隔周期不要太久，建议连续三周内完成。

3、正式实验的趋势我司不做保证。